Как и другие картины этих лет, созданные на религиозную тему, «Стигматизация Св. Франциска» была создана для частного заказчика. Доменико подписал произведение в нижнем левом углу. Вероятно, она была создана сразу после приезда художника в Рим. Эль Греко написал ее в иконописной технике, тщательно проработав детали, получив в итоге эмалеподобный вид.
На картине изображен самый поразительный момент из жизни Святого Франциска Ассизского, описанный в официальной биографии святого, так называемой «Большой легенде» Святого Бонавентуры.
С небес спустился серафим с шестью огненными крыльями, озарив сверкающим светом вершину Верны, осветил горы и долины вокруг. После того, как видение исчезло, на теле Франциска открылись стигматы — руки и ноги были пронзены гвоздями, черными, будто из железа, с большими круглыми шляпками, на левой стороне груди зияла глубокая кровоточащая рана, словно от удара копьем. Еще два года до смерти носил святой на своем теле стигматы, скрывая их от любопытных глаз.