Картину отличает многофигурная композиция и оригинальный «многослойный» сюжет с богатой скрытой символикой. На полотне изображен Святой Лука — один из евангелистов, пишущий портрет Богородицы с младенцем Христом на руках, причем фигура Святой Девы присутствует на картине в двух видах — так сказать, «в оригинале», парящая в облаках и поддерживаемая пухлыми херувимами, типичными итальянскими «путти».
Считается, что евангелист Лука был художником, поэтому многие живописцы состояли в гильдии Святого Луки. На картине же в образе святого мастер изображает самого себя, который пишет с натуры пресвятую Богородицу. За спиной сидящего на изящном резном табурете лежит огромный бык — это животное в своей крылатой ипостаси было символом евангелиста Луки.
Каждый из евангелистов имел свой собственный символ, все вместе которые назывались Тетраморф. В этой сложной и во многом загадочной картине соединилось возвышенное и земное — святые и боги, а также простые люди, как, например, подмастерье художника, растирающий краски в соседнем помещении и видимый зрителем через открытую дверь.
Как было принято в манере письма маньеризма, позы у фигур сложные, даже вычурные, используется много драпировок и богатых отделочных материалов, цветовая гамма богатая, но не интенсивная, немного «припыленная», благородная и сдержанная.